作者：倪晨明,倪灿荣,金钢
文章来源：中华肝胆外科杂志,,26(08)
摘要胰腺导管腺癌(PDAC)的发病率正在上升，预计将成为我国第二大癌症死亡原因。尽管人们对PDAC的了解取得了重大进展，但PDAC患者的生存率仍不尽如人意。PDAC的独特之处在于其明显的增生性改变，产生了一个由免疫细胞组成的大间质空间，包括免疫细胞、生长因子、细胞外基质和成纤维细胞，构成了肿瘤微环境(TME)，可占肿瘤的15%～85%。TME在PDAC的肿瘤进展和化疗耐药中起着重要的作用，虽然对PDAC有许多有希望的靶点，利用TME使其进入早期临床试验，但尚无显著改善临床结果的治疗方案。目前正在研究多种靶向治疗方法有可能更好地结合基质耗竭、药物输送和免疫调节，从而在延长PDAC患者生存期方面取得进展。本综述将围绕TME免疫细胞、生长因子、细胞外基质和成纤维细胞以及TME成分产生的治疗靶点的研究进行讨论。
胰管导管腺癌(PDAC)的发病率正在上升，到年预计将超过乳腺癌、前列腺癌和结肠癌，成为全球第二大癌症死亡原因，仅次于肺癌。PDAC占所有胰腺肿瘤的90%以上，其预后远低于所有实体肿瘤。目前，最有希望的治愈手段仍然是手术治疗结合辅助治疗。然而，大多数患者在诊断时已出现远处转移，不能接受手术治疗。
PDAC的独特之处在于其能产生大量的基质成分，包括免疫细胞、炎症细胞、生长因子、细胞外基质(ECM)和成纤维细胞。这些细胞在肿瘤中所占的比例可能在15%～85%，被认为增加了PDAC有效治疗的难度，并导致了对包括吉西他滨在内的化疗方案的内在抗药性。当前大量的研究工作集中在肿瘤与基质的关系上，本综述旨在勾勒出这些成分以及它们如何被用于病理环境和开发有针对性的治疗方法上。
一、胰腺癌的微环境
由于KRAS癌基因的激活突变，导致腺泡到导管上皮化生，随后转变为胰腺上皮内瘤变(PanIN)的分级增加，包括p16/CDKN2A、TP53和Smad4等在内的多个抑癌基因获得额外的体细胞突变，最终导致PDAC发生。从腺泡细胞到腺泡细胞的进展伴随着大量的间质产生，这是复杂的肿瘤微环境(TME)的基础。这种微环境是异质的，由细胞和非细胞组成，细胞成分包括基质、癌相关的成纤维细胞、肌成纤维细胞、胰腺星状细胞、血管和免疫细胞；非细胞成分包括胶原、纤维连接蛋白和多种可溶性因子(细胞因子、趋化因子和ECM中的生长因子)组成。
这种微环境不是静态的，而是不断变化。因此，Hingorani等年建立了胰腺癌的KPC小鼠模型，重构了人PDAC中观察到的密集间质反应和免疫微环境的许多关键特征。该小鼠模型的建立具有重要的意义，为研究复杂的微环境及潜在的治疗靶点奠定了基础。
1．基质：
年Bachem等在正常大鼠胰腺组织和正常人胰腺中发现具有维持结缔组织结构功能的胰腺星状细(PSCs)。在正常人胰腺中，PSCs约占实质细胞的4%～7%，在静止状态下其胞浆内含有维生素A脂滴。活化的PSCs合成大量的ECM沉积在胰腺，从而导致胰腺纤维化的发生。胰腺的慢性炎症可以激活PSCs，导致维生素A脂滴丢失，呈现肌成纤维细胞样表型，表达α-平滑肌肌动蛋白，以及过多沉积的ECM。
2．免疫细胞：
虽然PDAC的TME主要由密集的间质组成，但其中也充满了免疫细胞。从正常胰腺、瘤变到PDAC过程中，始终伴随着炎症而产生大量的免疫细胞。Bang等的大样本随访研究证实慢性胰腺炎患者与PDAC有显著的相关性，慢性炎症被认为是由于释放炎症介质后持续激活免疫反应而发生。这些免疫炎症细胞在特定环境下表现出功能的改变，最终导致免疫抑制信号的产生和炎性细胞因子的侵袭，促进肿瘤进展。在PDAC的前期病变中会出现M2型肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、骨髓源性抑制细胞(MDSCs)和调节性T细胞，并在侵袭性肿瘤中持续存在，目前已在小鼠诱导免疫抑制实验中成功。
(1)TAMs：TAMs在多种肿瘤类型中已被发现并证实其分布与预后密切相关。在PDAC中，肿瘤细胞可诱导巨噬细胞，使其分化并培养成M2表型(以CD和CD为特征)，进而促进肿瘤的生长、血管生成和转移。目前一项针对转移性胰腺癌患者的以小梁蛋白(曲贝替定)为靶点的第二阶段实验正在进行(NCT)。曲贝替定可引起由巨噬细胞及Caspase-8通路依赖的细胞凋亡及其相关受体的表达，最终以单核吞噬细胞为靶点。
TAMs还有多种潜在的治疗靶点，包括巨噬细胞表达的集落刺激因子1受体，增强抗原提呈及抗肿瘤T细胞免疫反应。研究表明诱饵受体3在PDAC中的表达与生存时间呈负相关，可下调巨噬细胞主要组织相容性复合体-Ⅱ和人类白细胞抗原DR的表达，使其成为调节PADC中巨噬细胞的潜在靶点，但需要对这些潜在靶点进行进一步临床研究。
(2)MDSCs：MDSCs是未成熟髓样细胞的混合体，由多形核粒细胞MDSCs和单核MDSCs两种细胞组成。Bang等在小鼠模型中发现MDSCs随着PDAC从癌前病变向恶性肿瘤的进展而表达增加，抑制MDSCs是PDAC潜在的治疗靶点。目前有研究表明小鼠骨髓间充质干细胞选择性耗竭促进肿瘤细胞凋亡并导致CD8＋T细胞浸润增加。但在PDAC患者中有多种抑制MDSCs的方法需要进一步探索。
(3)肿瘤浸润性T细胞：PDAC基质中富含CD3＋T淋巴细胞，其主要成分为CD4＋辅助性T(Th)细胞、CD8＋T细胞和CD4＋CD25＋FOXP3调节性T细胞。发现在胰腺肿瘤中的CD4＋T细胞通过分泌IL-17促进PanIN的形成，KRAS癌基因激活驱动PanIN向PDAC发展，并抑制CD8＋T细胞的抗肿瘤活性。CD4＋Th细胞分化为两个细胞亚群，即Th1和Th2。Th1细胞分泌IL-2和γ干扰素，介导细胞免疫反应；Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13，与体液免疫反应相关。Th2细胞参与杀伤肿瘤，然而在PDAC中的大多数Th2细胞具有促进肿瘤的作用。DeMonte等研究显示肿瘤浸润细胞内的Th2/Th1比值升高是IIB/III期胰腺癌患者不良预后的标志物。
3．ECM：
ECM占PDAC肿瘤体积的90%，由胶原蛋白、纤维连接蛋白和多种可溶性因子组成，包括细胞因子、趋化因子和PSCs分泌的生长因子，这些因素提供了其结构支持，并促进分化、重构及癌变。体外实验研究表明，I型胶原促进PDAC细胞的增殖、迁移和粘附，还与PDAC细胞表面的IV型胶原和整合素受体相互作用，促进增殖，维持迁移表型从而逃避凋亡。TME的各个组分协同工作，以维护肿瘤增殖与侵袭。
二、TME免疫治疗靶点
1．Hedgehog(Hh)：
哺乳动物中存在三个Hedgehog的同源基因，即SonicHedgehog(SHH)、IndianHedgehog(IHH)和DesertHedgehog(DHH)，分别编码Shh、Ihh和Dhh蛋白。Hh信号通路失调与PDAC形成密切相关。Hh虽然在发育中的胰腺中不表达，但目前研究发现在胰腺癌前病变及胰腺癌有一定表达。Shh蛋白随着胰腺癌病变的进展，其表达量逐渐增加。
Hh的信号传递受靶细胞膜上两种受体Patched和Smoothened的控制，其配体通过旁分泌效应激活PSCs，促进间质的增加，最终导致肿瘤的发展。尤其是胰腺癌细胞可产生Shh，又与PSCs上的受体Patched结合，通过消除Smoothened的抑制作用而激活细胞内信号，从而激活转录因子Gli1进入细胞核，调控ECM蛋白中的细胞发生分化、增殖和凋亡。这些被激活的PSCs会沉积在细胞外的基质蛋白上，从而形成一层较厚的基质，抑制对治疗药物的接触，产生耐药。
目前药物Hh信号通路抑制剂可以抑制PDAC的发展。Vismodegib是一种Smoothened蛋白抑制剂，通过控制Gli蛋白水解抑制Hh靶基因的转录。已有多项临床前研究使用Hh靶向治疗胰腺癌，例如生物碱环戊胺及其衍生物，包括IPI-、Smoothened拮抗剂和5E1Shh阻断抗体等相关药物的研发。然而，早期的研究未能在人类身上显示出持续的疗效。多项临床试验结果显示类似于其他多种Hh靶向药物，临床前期的研究显示出了希望，但在早期临床试验中未能得到良好的结果。
2．富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC):
SPARC也称骨连接蛋白，是成骨细胞在骨形成过程中分泌的一种糖蛋白，在PDAC中，SPARC表达在基质中的ECM，与预后差有关。在临床前期研究中，SPARC表现出对白蛋白结合型紫杉醇(一种白蛋白纳米颗粒缀合物)的高亲和力，可以增加药物对肿瘤细胞的传递，直接作用于间质细胞，导致间质消耗。此外，在使用吉西他滨联合纳布紫杉醇的临床试验中，发现在肿瘤组织中SPARC表达的增加与中位总生存率的提高显著相关。然而，另一项数据显示白蛋白结合型紫杉醇在SPARC缺陷模型中同样有效，表明其作用并不完全依赖于基质靶向，需要更多的研究阐明其机制。
3．结缔组织生长因子(CTGF)：
CTGF是一种在胰腺癌间质中表达的促纤维细胞外蛋白，在慢性胰腺炎和胰腺癌中表达增加。CTGF的作用机制是通过趋化因子信号通路上的CXC蛋白介导使其与生长因子及整合素结合，从而促进PDAC纤维化、胶原沉积，进一步促使PDAC进展和转移。CTGF还可刺激PDAC基质中的PSCs增殖和ECM蛋白生产。Neesse等研究显示FG-与吉西他滨联合用药，可促进肿瘤负荷小鼠细胞凋亡。尽管在这些研究中肿瘤基质的大体外观没有改变，但对抗凋亡蛋白的表达有显著下调并对生存率改善有所帮助。
目前研究FG-联合吉西他滨及紫杉醇治疗晚期不可切除胰腺癌的疗效正在进行前期试验(NCT)。单克隆抗体FG-和阻断CTGF与其受体相互作用的多种拮抗剂(包括sb)在临床前期研究中对改善化疗反应和提高小鼠模型的存活率均有效。
4．透明质酸：
透明质酸是在PDAC基质中发现的一种非硫酸化多糖胺多糖。透明质酸与胶原协同作用使PDAC出现纤维增生。在PDAC中，高水平的透明质酸与间质液压增加和促结缔组织增生一起产生灌注屏障，阻碍药物到达肿瘤靶点。透明质酸与CD44结合，进而阻碍肿瘤内血管生成和诱导化疗耐受性。由于上述发现，透明质酸相关的治疗是PDAC的一个有希望的靶点。
聚乙二醇化重组人PH20透明质酸酶(PEGPH20)是一种降解透明质酸的酶，在小鼠和人的Ⅰ、Ⅱ期试验中都有很好的应用前景。在NCT项目中，与单独使用吉西他滨的患者相比，使用吉西他滨和PEGPH20联合治疗的晚期PDAC患者的总体生存率(OS)和无进展生存期(PFS)均有改善。PEGPH20与包括吉西他滨/紫杉醇等其他药物的研究中，Hingorani等发表了第二阶段研究结果，该研究对晚期PDAC患者进行了PEGPH20联合吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇的试验，在透明质酸高的肿瘤患者中，使用PEGPH20＋吉西他滨＋白蛋白结合型紫杉醇联合治疗与吉西他滨＋白蛋白结合型紫杉醇联合治疗的患者中位总生存期分别为11.5个月和8.5个月。
到目前为止，PEGPH20和Hedgehog抑制剂在胰腺癌治疗中的作用喜忧参半，有成功和失败，这表明有必要对肿瘤间质生物学进一步研究。?zdemir等研究显示间质除了对治疗产生物理屏障外，还可能具有抑制肿瘤的特性。这一观点解释了为什么基质耗竭可导致恶性肿瘤的侵袭性。因此，调节基质同时不消耗基质可能是开发有效靶向治疗的关键。
5．维生素A和D：
Froeling等体内外实验证实，用维生素A类似物处理体外培养的小鼠肿瘤负荷模型中活化的PSCs，并通过恢复分泌的脆性相关蛋白4，最终下调wnt/β-catenin信号通路，降低PSCs的旁分泌信号，最终导致癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学活性的下降。Sherman等研究结果显示维生素D受体的激活，使基质通过一种平时呈休眠状态并较少突变表型的PSCs重新编程。PDAC小鼠模型用维生素D类似物钙基三醇和吉西他滨联合治疗，可以减少炎症，增加更多的休眠间质，增加吉西他滨的释放，比单独使用吉西他滨的小鼠能更好地提高存活率。
6．吡菲尼酮：
吡菲尼酮是一种已知的抗纤维化药物，最初用于治疗肺纤维化，可降低包括转化生长因子β和胶原在内的多种纤维化介质的表达。Suklabaidya等通过体外实验证实吡菲尼酮治疗可抑制PSCs的增殖、侵袭、迁移和肿瘤生长。主要表现在血小板源性生长因子A、骨膜蛋白、肝细胞生长因子、纤粘蛋白和Ⅰ型胶原在PSCs中的表达减少。Suklabaidya等的结果显示α-平滑肌肌动蛋白也有减少，表明PSCs的激活受到抑制。在临床前期研究中，与单独吉西他滨相比，联合给药减缓了肿瘤的生长。
7．血管紧张素抑制剂：
目前用于治疗高血压的血管紧张素抑制剂如奥美沙坦和氯沙坦在胰腺癌治疗中显示出一些应用前景。血管紧张素II通过蛋白激酶C和表皮生长因子，在细胞外信号调节激酶途径刺激PSCs增殖、迁移和ECM生产，该发现提示了使用血管紧张素抑制剂的多个临床前研究。
8．免疫细胞：
慢性胰腺炎是PDAC的一个危险因素，炎症和由此产生的免疫反应一直被认为在PDAC中起着重要作用。许多免疫共刺激因子和检查点调节因子均被证实是间质的一部分，并参与PDAC的发生发展。然而，与其他肿瘤类型不同的是，PDAC的免疫治疗在临床上几乎没有实质性进展，可能是由于密集的间质导致免疫抑制环境缺氧。尽管如此，炎症和免疫反应在疾病进展中的作用目前仍在研究中。Beatty等研究表明CD40是肿瘤坏死因子受体家族成员，在免疫调节、凋亡和巨噬细胞依赖的抗肿瘤T细胞免疫中起着重要作用。
进一步实验分别用CD40单抗和吉西他滨分别治疗KPC小鼠荷瘤模型，结果均能使30%的小鼠肿瘤消退，二者无明显差异，这可能与巨噬细胞介导Caspase3诱导的间质耗竭和I型胶原含量的降低有关。Beatty等在动物实验的基础上还进行了一期临床试验，将CD40激动剂CP-与吉西他滨联合应用于晚期PDAC患者，结果与单独使用吉西他滨的患者相比，18%的患者出现部分反应，无进展生存期及总生存期增加，并观察到肿瘤浸润的淋巴细胞和巨噬细胞减少。
程序性死亡受体-1(PD-1)是一种表达于活化T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、树突状细胞的免疫检查点分子。PD-1与配体PD-L1和PD-L2结合，激活和抑制T细胞活性，使肿瘤细胞免疫逃逸。PD-1和PD-L1在部分PDAC中均有表达，且与预后不良有关。虽然靶向PD-1和PD-L1在其他肿瘤中取得明显疗效，但PDAC的临床试验并没有显示出作为一种单一疗法的显著反应。然而，有多个试验使用PD-1和PD-L1联合其他药物。免疫检查点抑制剂CTLA4抗体药物Ipilimumab在小鼠模型中也显示出了应用前景，提高了小鼠的存活率，但Ⅱ期临床试验效果却不尽如人意。
三、小结
PDAC特点是有非常高密度的基质，包含非恶性支持细胞和肿瘤细胞(70%的基质和30%的恶性肿瘤细胞)，由一层癌细胞外包一层基质，再一层癌细胞再一层基质的混搭形式，作用机制非常复杂。随着对胰腺癌微环境认识的不断深入，免疫治疗仍是未来胰腺癌治疗的突破热点。个体化、多靶点的精准治疗联合免疫治疗是未来胰腺癌免疫治疗的主要方向，有望为胰腺癌治疗带来新的希望。
参考文献
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