——被低估的组织样本
在上篇我们较为详细的介绍了宏基因组二代测序（mNGS）作为临床新增的一类可选择的病原体检测手段，其应用面之广，样本类型之丰富，优势之明显，已经为许多专家所推崇，大量的文献案例也印证了这一点。继《宏基因组样本论上篇》我们讨论了当前各系统感染，不同样本的适用情况问题，本篇我们继续研究宏基因组临床应用的样本应用。上篇提到，组织是病灶部位最直接的样本类型，其代表了感染的客观真相，但是由于组织的取材会对机体有一定的损伤，同时其人类基因组背景信息较多，病原种类和含量相对较少，组织样本在宏基因组应用中的选择较难取舍，因此，本文拟就组织样本的应用价值进行深入探讨，为拓展宏基因组的应用打开新的视角，思路如下图。、组织mNGS检测应用现状分析
组织是感染病原体的最终定植与繁殖部位，是病灶最直接最具有代表性的样本类型，所以在感染性疾病病原诊断中，组织是常用的样本类型。组织样本除了可以用于病理检查外，还可以进行培养、涂片镜检、核酸检测等多种病原学检测。
随着mNGS检测技术在临床中的应用日益增多，使用组织样本进行检测的案例报道也越来越多。Zhou等人[]在研究慢性肺脓肿患者治疗方案时，其中有例患者最终通过肺组织mNGS检测到感染病原体，分别为微小微单胞菌(P.micra)、微小微单胞菌(P.micra)合并中间普雷沃菌（P.intermedia）及群集链球菌（S.constellatus）。临床根据mNGS检测结果，调整使用的抗生素使得患者痊愈出院。Zhang等人[]后来又报道了临床表现为肋骨内的病理溶解性骨病变并有相关软组织肿块的例患者通过组织病原学检查检出新生隐球菌，两名患者均接受氟康唑口服治疗后达到痊愈。Chen等人[3]报告了一例7岁的中国男性，他患有年多没有任何症状的慢性进行性肺部病变疾病，直到病变到达会厌部并导致进行性咽痛，医院进行诊治。通过支气管肺泡灌洗液(BALF)和会厌组织培养，以及会厌组织和肺病理检查均未见阳性结果，但mNGS在会厌组织和BALF中均检测出荚膜组织胞浆菌，最终病人使用伊曲康唑胶囊治疗成功（图）。
图患者病灶拍照及CT影像A：喉镜显示会厌明显肿胀，被白膜覆盖，双侧声带增厚充血；B-：治疗前CT显示弥漫性、不均匀磨玻璃密度影和不规则小粟粒状结节；C-3：治疗开始后，病灶逐渐消退（C：治疗后一个月，C：治疗后两个月，C3：治疗后三个月）；D-：停药三个月后病灶消失无复发。可见，mNGS检测确实极大的帮助了临床病原病因诊断。报道文章不断涌现，通过Pubmed搜索“((tissue)AND((mNGS)OR(NGS))AND(infect)”关键词获得近0年的报道文章，可得到7个搜索结果，约9%的文章在近五年内发表，且数量呈迅速上升趋势（表），说明其应用价值日益突出。但相对目前mNGS使用较多的BALF、脑脊液等样本，组织样本应用潜力较大。表感染性疾病中组织mNGS检测文章数量统计、选择组织进行病原学mNGS检测的成因分析.组织是感染发生地，样本最具有代表性构成传染和感染需要满足三个条件：病原体、人体、环境，三者此消彼长。病原体侵入机体并在机体内定植、繁殖从而引起疾病。病原体定植的部位通常就是组织或者血液（图）[4]。因此对于非血液系统感染的疾病来说，组织是病原体感染机体的发生地，是最直接的样本，虽然组织取材难度大，且具有一定的损伤，但是组织依然是病原学检查优先选择的样本类型之一。
图病原微生物侵入机体及播散示意图
.组织中存在潜在病原菌，是机会致病菌的“老窝”06年，美国国家癌症研究所肿瘤流行病学和遗传学分会、意大利米兰大学、美国巴尔的摩马里兰大学医学院基因组科学研究所联合发表了关于肺部微生物菌群及流行病学和临床关系研究[5]，显示肺微生物不同于口腔、鼻腔、粪便、皮肤和阴道的微生物群落。在非恶性肿瘤肺组织样本的主要微生物以变形杆菌门为主（占60％）。在属水平上，肺组织主要微生物群包括五个变形菌属：不动杆菌属、假单胞菌属、罗尔斯顿菌属和两个未知属级组，分别来自丛毛单胞菌科和草酸杆菌科（图4b）。
图3非恶性肺组织与其他人体部位微生物的比较
图4非恶性肿瘤患者肺组织微生物的分类（a门水平分类剖面。b属水平分类图）
在肺组织中发现的微生物中存在NIAID（美国国家过敏和传染病研究所）病原体A-C分类和PATRIC数据库定义的“条件致病菌”：葡萄球菌属、链球菌属和伯克霍尔德菌属，但平均相对丰度较低，约为%。同时假单胞菌属虽然经常存在于肺组织中且不在NIAID病原体列表之内，但它的存在可能对免疫抑制患者具有致病性。而在癌症晚期患者的组织中栖热菌属含量更丰富，而在发生转移的肺癌患者中肺组织中的*团菌占比较高。
该文章说明在肺组织中定植的微生物可能是潜在的致病菌，或者是在一定条件下，可以转变为引起人类疾病的病原体，所以肺组织是这类病原体的“老窝”，通过肺组织样本的病原检测可能可直接找到致病的“坏蛋”。
.3特殊病原的组织样本诊断率高
对于可能感染人的有些病原体如侵袭性真菌、胞内菌以及一些其他特殊病原体，使用组织样本检测具有不错的检测表现，可能与病原的侵染机制以及其在组织样本中含量可能较高有关。
●肺炎衣原体的鉴定
肺炎衣原体(Chlamydiapsittaci)是引起肺炎衣原体肺炎的一种人畜共患传染病致病菌。00年，GU等人[6]报告了5例肺炎衣原体肺炎病例，其中3/5例通过肺活检组织mNGS测序检测到肺炎衣原体的存在，/5例通过支气管肺泡灌洗液检出。所有患者最终通过多西环素加莫西沙星组或单用莫西沙星组治疗后治愈。●活动性肺结核（TB）的鉴定JIN等人[7]使用mNGS分析对活动性TB的诊断准确性，在纳入研究的80个样本中共收集了99个肺组织样本。在肺结核诊断中，通过肺组织诊断TB的敏感性（88.9%）显著高于肺泡灌洗液（55.0%）和痰液（5.3%），是传统培养敏感性（.%）的4倍以上。而在肺外结核的诊断中，肺外组织mNGSTB检测的敏感度为40.9%，略低于浆液（50.0%）或脓液（50.0%），但是其特异性（00%）高于其他样本类型（表）。可见，对于活动性TB的诊断，肺组织或肺外组织都是极重要的样本选择。表mNGS与培养法在诊断肺结核中的诊断性能表现
●隐球菌感染的鉴定Zhang等人[]报道了例患者表现为肋骨内的病理溶解性骨病变及相关软组织肿块，为明确是否是感染病因，从而做了组织病原学检查，最终在例组织样本中均检出新生隐球菌，患者均接受氟康唑口服治疗，感染均被成功根除。
●特殊病*的鉴定Cai等[8]通过mNGS的方法在研究肺腺癌患者血液和癌组织样本中病*的组成时发现多瘤病*仅存在于癌组织标本中，虽然文章针对这个发现想讨论的是肺癌与病*感染的关系，但是文中的取材也提示了肺组织样本相对于血液样本来说更加容易检测到相关病原体。以上表明，组织作为临床宏基因组的检测样本具备一定的可行性，并且有非常充分的理论依据。3、组织在mNGS检测中整体性能组织样本作为宏基因组应用优选样本具有一定的理论依据，但临床实践中性能表现如何呢？3.在下呼吸道感染中的应用表现在下呼吸道感染中，大多数进行肺微生物学研究时使用的是支气管肺泡灌洗液，而不是肺组织。但是组织依然是肺部感染病原学诊断的主要样本类型之一，在下呼吸道感染病原诊断中占有重要地位。08年，王辉教授等[9]报道了使用肺活检组织mNGS检测成功地识别了5例感染患者，其阳性率为75%（5/0），远远高于传统培养方法。同时说明肺组织样本可以用于肺部感染病原的诊断，尤其是在难检测病原体及厌氧菌、真菌和结核分枝杆菌的检测中具有较高的检测效率（表3）。表3mNGS与传统实验室检测方法比较
00年，冯靖教授等人[0]发表了探讨比较径向支气管内超声(R-EBUS)引导下经支气管肺活检(TBLB)和mNGS联合应用于周围肺感染性病变的诊断价值的文章，结果显示TBLBmNGS检测总阳性率为76.4%，极大的帮助了肺部周围感染疾病的诊断。同年0月，其团队又发表了mNGS在周围性肺病变(PPLs)诊断中的应用及最优的样本选择，比较了TBLB样本、支气管针刷(BB)样本和BALF样本三者之间mNGS检测敏感度，结果没有显著差异，但TBLB样本中的特异性最高（达00%），可以较好的帮助临床进行准确诊断[]。
3.组织在神经系统感染中的应用表现00年Ramachandran等人[]发表了宏基因组测序在神经系统感染中的应用，文中提到大脑或脑膜组织活检样本用于mNGS检测也是有价值的。但这一方法的成功与否取决于微生物是否存在于提取核酸的特定组织中和能否准确的取得脑组织样本。组织样本的液氮冷冻保存方式一方面避免了核酸的降解，另一方面避免了与福尔马林固定和石蜡包埋有关的环境微生物污染，同时也避免了在病人过世数小时或数天后进行尸检前胃肠道发生的微生物移位的问题。3.3组织在多种局灶性感染中的临床应用表现09年，Zhang等人[3]研究了mNGS在局灶性感染中的临床应用价值，结果显示mNGS对多种组织的诊断阳性符合率分别为86.30%(95%CI：75.79~9.88%)，而培养的阳性符合率45.%(95%CI：33.68~57.4%)，其他常规方法的阳性符合率57.53%(95%CI：45.43~68.84%)，组织mNGS与传统检测方法符合率存在显著差异(P0.05)。同时，用mNGS鉴定病原菌所需时间周期为3-55h，短于传统培养法(8.36h)，二者也存在显著差异（P0.05)（图5，图6）。所以利用组织样本结合mNGS进行局灶性感染的病原学诊断中具有广阔的应用前景，可使临床医生做出更及时、更有针对性的治疗决策。图5研究中使用组织以及病原体阳性对应的样本数量
图6不同病原体检测所用时间比较图
4、宏基因组检测组织样本优选策略
在临床感染性疾病的诊断中，使用组织样本进行病原学检测的疾病主要涉及：下呼吸道感染、颅内感染、骨与关节感染、眼部感染、腹腔感染、皮肤及软组织感染及其他感染等[4]。不同的感染系统，在选择组织样本作为优选样本时候，有不同的应用方案。
4.下呼吸道感染在下呼吸道感染中，一般采集痰液、鼻咽拭子及支气管镜标本等进行病原学检测，但当高度怀疑诺卡菌、分枝杆菌、侵袭性真菌（隐球菌一般除外）时，可考虑同时或优先取肺组织进行检测[4]。
●肺放线菌病的组织病原学诊断放线菌病是一种罕见的由放线菌引起的慢性肉芽肿感染。放线菌病的症状是非特异性的，与其他慢性化脓性胸部疾病相似。肺部放线菌病的非特异性临床症状和影像学表现使其诊断困难。00年，一项纳入3例肺放线菌感染患者的回顾性分析显示，与痰培养和下呼吸道培养样本相比，组织样本培养或组织病理的放线菌检出率更高，达（7/8,87.5%）[5]。同时，对于影像学异常的患者，组织活检能帮助患者明确是否存在感染的情况，比如AkiraTokuda等人[6]通过肺活检明确诊断一例无症状但影像学长期异常的肺放线菌感染病例。这些案例都体现了组织样本在诊断肺放线菌病中具有优势，可提高临床诊断效率。●侵袭性曲霉病的组织病原学诊断曲霉是一种条件致病真菌，侵袭性曲霉病的主要危险因素包括持续的中性粒细胞减少、长期大剂量皮质类固醇治疗、器官移植、遗传性中性粒细胞功能障碍等。侵袭性曲霉感染通常发生与环境有直接接触的器官如肺腔、鼻窦和外耳道，支气管肺泡灌洗液和肺活检组织是诊断的首选标本[7]。HagenFrickmann等[8]比较了石蜡组织NGS检测和组织病理学检测结果的一致性，NGS在7例侵袭性真菌病患者中鉴定出5例潜在的病原学相关病原体，NGS在6例阿米巴感染患者中鉴定出例潜在的病原学相关病原体。结果表明，使用NGS可以对石蜡包埋组织进行病原体诊断，但是其技术需要进一步优化（图7）。
图7文章研究思路图
4.高度怀疑颅内感染对临床高度怀疑颅内感染但经反复外周血及脑脊液检查均无阳性病原学发现的患者，如治疗效果不佳可考虑脑组织活检，一般可采取小开颅活检（脑表面、脑膜及浅层病变）或立体定向脑组织活检（深部病变）[4]。
目前关于疑似颅内感染的患者使用脑组织进行病原学诊断的文章频繁发表。尤其是免疫缺陷的患者，其特别容易受到神经侵入性感染，mNGS可以识别少见或新发病原微生物，因此对研究免疫缺陷患者慢性脑膜脑炎的病因探查极有帮助。一名来自澳大利亚的34岁男性患者，患有先天性低丙种球蛋白血症且软骨发育不良。在外出旅游后出现急性脑炎症状，转入ICU治疗。院内进行的传统病原学筛查均无果，在传统方法无效的情况下，院方采用了mNGS检测技术，对患者的脑脊液和脑组织进行检测，发现卡奇谷病*(CVV)特异性序列，并在对患者的脑组织和CSF进行RT-PCR和免疫组化验证实验，确定患者感染由蚊媒传播的CVV。这个研究表明对组织样本应用mNGS探查感染病原菌具有强大优势[9]。
Wilson等人[0]使用mNGS诊断脑膜炎和脑炎时，有7例患者在脑脊液以及各种相关检测为阴性时，通过其脑组织的mNGS检测获得感染病原体信息，改善了神经系统感染的诊断，并在某些病例中提供了可供临床参考的信息。
Salzberg等人[]通过NGS和一条新的计算分析方法来检测0例常规的临床和微生物学研究结果为阴性或不确定的神经疾病患者的脑或脊髓活检组织中是否存在致病微生物。脑活组织检查的微生物群分析结果表明，在0例病例中，有8例的临床结果与NGS结果一致，其余例的临床结果与NGS的结果无关。对于阴性NGS结果，应谨慎考虑此类疾病的原因是否是感染后或自身免疫性炎症反应，而不是活动性感染（图8）。
图8个样本微生物种属热图作者认为基于组织样本的mNGS检测能有效捕捉定植在组织生态位中的微生物基因组（如细菌、真菌和病*），为研究感染性病原体在神经炎症性疾病发病机制中的潜在作用提供了一个重要的新机会。
4.3骨与关节感染在骨科，骨组织是重要的采集样本之一。在骨髓炎患者中，可通过影像引导或手术采集骨活检组织，建议在深浅不同位置感染部位各取一小块组织，分别加入几滴生理盐水湿润，尽快送检。当怀疑布鲁菌、放线菌以及多种厌氧菌感染时，应及时告知实验室[4]。当怀疑分枝杆菌关节炎时，由于滑膜液检出率低，应尽可能采集滑膜组织，室温立即送检。当怀疑存在关节假体感染时，除了采集假体标本外，还需采集3~4块感染部位独立组织进行病原检测[4]。00年，张文明教授团队[]探讨了mNGS在骨关节感染(OAI)标本中的诊断价值。其中3（3/30）份为组织，mNGS组织样本的阳性率与培养相当，具有一定的诊断参考价值。同年，一项研究采用感染周围组织作为样本进行核酸提取，行mNGS并与传统病原检测方法进行敏感性、特异性、阳性预测值等方面的比较，结果发现mNGS优势更明显（图9）[,3]。图9通过宏基因组二代测序检测假体周围组织中的细菌以上案例表明在骨与关节感染中，是比较倾向于或者可直接采取感染部位组织作为进行mNGS病原学检测样本。
4.4眼部感染眼部感染仍然是全世界罹患眼睛失明的主要原因。当眼部感染发生时，可进行不同感染部位的病原学检测，标本类型包括溃疡物、角膜刮取物、活检组织、房水及玻璃体抽吸物等。一般取结膜组织标本时，无论是单眼感染还是双眼感染，均建议取双眼标本[4]。医院眼科对0-0/05-期间的例住院患者的送检标本进行分离培养，共分离培养出病原微生物株，其中革兰阳性菌50株，革兰阴性菌07株，真菌9株，其中，结膜囊组织培养阳性率最高，高达.98%。体现了结膜囊组织在眼部感染中是较好的样本代表。在一项研究中[3,4]，回顾性评估了6例感染性角膜患者和4例无感染患者的组织样本（角膜），mNGS成功鉴定了4例细菌和分枝杆菌感染，5例真菌感染，3例棘阿米巴感染，3例病*感染（包括例巨细胞病*与细菌合并感染），例寄生虫感染。结果表明mNGS与算法相结合，可在福尔马林固定角膜标本中广泛识别病原体，在临床诊断和研究中具有潜在应用价值（图0）。图0眼部感染组织病理学特征
由此可见，眼部感染中，不管是石蜡切片组织样本，还是结膜囊组织样本，对于眼部感染鉴定的优势都较明显，可以用于辅助诊断，同时mNGS在眼部感染中也有较好的应用前景。
4.5腹腔及其他感染腹腔感染的患者，采集标本一般为腹水、腹膜透析液，也可以采集病变部位抽吸物或术中病变组织。当高度怀疑自发性腹膜炎、继发性腹膜炎、透析相关性腹膜炎、结核性胆道感染、结核性脾脓肿、继发性胰腺炎等，可采集病变部位抽吸物或术中病变组织，并在小时内送检，需厌氧培养的应立即送检或采用厌氧专用转运培养基送检。在皮肤及软组织感染时，为避免定植菌的干扰故不建议采集伤口表面样本，应彻底清创后或术中选取合适组织活检。对于同时合并骨髓炎的患者，选择清创部位的骨活检是最有价值的。对于其他感染疾病的样本选择，建议根据实际感染情况，评估组织应用的可行性。5、准确地采集组织至关重要引用《礼记》一句话：“君子慎始，差之毫厘，谬以千里”。该句说明了准确起始的重要性。PatrickMurray主编的著名的《临床微生物检验》一书中也提到：正确的微生物学检验始自正确的标本采集，临床医师、护士及检验技师都必须通晓其采集要领。在临床中，高质量标本是高质量检验的第一步。为了取得准确的、可靠的检验结果，必须取得高质量的标本。在采集的各种样本中，组织样本的采集极具挑战性，如何准确的获得组织样本至关重要。然而影响准确采集组织的因素复杂，包括患者病情、感染时间、感染部位等。同时检测技术又具有一定的局限性，即便是使用最新的mNGS检测技术进行病原体检测，也同样易受样本采集准确度的影响。因为mNGS是一种直接通过基因组DNA或RNA来识别病原体的方法，如果病原体的核酸不存在于所采集的组织或者在组织样本中含量较低时，mNGS也将无法检测它，这一点限制与传统的检测技术一致。所以什么时候取组织、怎么取、取多少等问题成为大家